杭州师范大学谌容/殷晓浦团队Trends in Biotechnology综述│通过合成生物学方法拓展萜烯的结构多样性

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生命科学

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萜类化合物具有广泛的化学结构多样性及重要的生物活性，但这些结构多样性受到萜类结构的限制，其生物合成通常起源于可相互转化的五碳异戊二烯焦磷酸结构单元。近年来研究者们开发了一些新的合成生物学方法来拓展萜类化合物的结构多样性。近日，杭州师范大学谌容副教授、殷晓浦副教授及团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Trends in Biotechnology发表综述，系统地展示了通过共表达经典甲羟戊酸途径和C-甲基转移酶，或通过鳞翅目甲羟戊酸途径对非典型结构单元进行组合生物合成，从而增加非经典萜烯结构的可能性。此外，以法尼基焦磷酸类似物为底物在萜烯合成酶催化作用下，或以人工金属酶催化萜烯的环丙烷化也可产生萜烯衍生物。该综述进一步讨论了用于加速萜烯衍生物生物合成的人工智能等先进技术，为增加萜类化合物及其衍生物的多样性以及扩大其潜在应用提供了有价值的参考。

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萜类化合物是目前发现的8万多种天然产物中最大的类别之一，由于萜类化合物（比如榄香烯、青蒿素和紫杉醇等）具有抗癌、抗氧化、抗炎、以及抗菌等多种生物活性，所以在医药、食品等众多行业得到广泛应用。萜类化合物是由两种C5异戊二烯单元构成，即焦磷酸二甲基烯丙基酯（DMAPP）和焦磷酸异戊烯酯（IPP），这是两种可以相互转化的五碳代谢产物。C5异戊二烯单元通过头尾相连、头对头或头对中的反应线性连接，生成萜烯骨架。虽然这些骨架可以被萜类合成酶（TPS）进一步修饰，但是萜烯骨架的结构多样性被限制为保留五碳原子倍数的特征（5、10、15 或其倍数）。

除了产生经典萜类化合物的途径之外，自然界中的生物体还使用特殊的策略来生成非经典萜类化合物。例如，利用甲基转移酶（methyltransferase, MTs）转移S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosyl methionine, SAM）提供的额外甲基到异戊二烯双键处，生成甲基化异戊二烯骨架，从而合成一些非经典萜类化合物，如索多利芬，2-甲基异龙脑（2MIB），苯司他定等。另一种策略是鳞翅目在体内通过非经典的甲羟戊酸途径生成六碳结构单元Homo-IPP（HIPP）和Homo-DMAPP（HDMAPP），进一步缩合成生物体所需的C16-C18的保幼激素。这些策略为非规范结构萜烯骨架分子的生物合成提供了新的思路。因此，通过重新设计或重建工业微生物（如大肠杆菌和酿酒酵母）中现有的代谢途径，可以产生新的非天然萜类化合物。

I: 利用C-甲基转移酶引入非经典构建模块

C-甲基转移酶在天然C5单元的甲基化中起着至关重要的作用，其催化产物为甲基化的IPP/DMAPP类似物，可进一步通过酶促反应生成甲基化萜烯。C-甲基转移酶还可以使GPP和FPP甲基化，为非经典萜烯提供构建模块，促进了多样化的萜烯衍生物的生产（图1A）。这种策略既方便又实用。然而，甲基化修饰位点的局限性会在一定程度上限制产物结构的多样化。如表1 所示，已报道多种微生物来源的C-甲基转移酶产生非经典萜。需要注意的是，已报道的甲基转移酶以IPP为底物，仅HumMT可同时利用IPP和DMAPP，这可能是目前非经典萜烯产量较低的原因之一。

▲图1 萜烯的经典合成途径以及扩展萜烯甲基修饰衍生物的非经典途径

▲表1 C-甲基转移酶与天然萜烯合成模块产生非经典萜烯

II: 生产非经典倍半萜的组合代谢途径

通过不同生物合成酶的模块化组装得到的组合代谢途径，可用于扩大萜类化合物的多样性。鳞翅目或膜翅目昆虫体内通过一种改良的MVA途径生成IPP或DMAPP的甲基化产物，该途径从缩合丙酰-CoA和乙酰-CoA生成丙酰乙酰-CoA开始，从而替代了经典MVA途径中缩合两分子的乙酰-CoA生成乙酰乙酰-CoA，因此，丙酰-CoA的额外甲基通过鳞翅目改良MVA途径得到了保留。加州大学伯克利分校Keasling教授研究组将该途径与各种植物来源的萜烯环化酶相结合，成功得到了三种新型的非经典倍半萜烯。但IPP的甲基化位点仅发生在C4，且仅额外添加一个甲基，未检测到期望的多个甲基化修饰产物(图1C)。

III: 非经典萜类化合物的化学-生物合成

重组体内代谢途径以产生足够的替代底物，或化学合成这些化合物目前还具有相当大的难度。此外，许多天然萜类化合物和碳氢化合物骨架具有复杂且不稳定的结构。因此，通过化学方法制备非天然萜烯前体作为底物，在天然萜烯合酶催化下产生高度官能化的新型萜类化合物具有一定的优势。该策略不仅避免了复杂且冗长的体内途径来生产萜烯，而且对现有的萜烯生物合成方法是有力的补充。利用萜类合酶的底物混杂性，已经成功催化了化学合成底物，得到了一些非天然萜类化合物，如15-甲基-β-榄香烯等（表2）。在可见的未来，基因组挖掘、机器学习和高通量筛选，以及蛋白质工程技术越来越多地用于提高酶活性和拓展萜烯产物的多样性。

▲表2. FPP衍生物在萜类合酶催化下生成的萜烯衍生物

IV: 利用人工金属酶生产非经典萜烯

人工酶通常可对天然酶的底物识别位点、活性位点以及疏水微环境进行设计和优化。人工酶不仅可以作为化学反应的高效催化剂，还可以纳入天然或组合生物合成途径，从而获得由天然代谢途径和化学设计相结合的非天然产物。人工金属酶ArM 的金属离子作为酶催化中的辅助因子发挥着关键作用，并具有重要的调节功能。当在细胞中表达时，人工金属酶可以发挥酶的选择性和活性调节作用，以及防止细胞内组分失活的保护作用（图2）。

利用Ir（Me）P450酶这一特性，Keasling课题组和Hartwig课题组合作，通过构建异源生物合成途径，并结合人工酶Ir-CYP119转运系统，将包含天然酶和铱-卟啉复合物的ArMs的体系转运到细胞中，以较高的非对映选择性成功催化得到了非天然产物环丙基柠檬烯。但用于人工金属酶的金属原料Ir属于稀有贵金属，显著增加了合成成本。此外，过渡金属催化的C-H功能化已逐渐成为当今化学催化研究的热点领域。

▲图2 柠檬烯天然生物合成途径与人工金属酶 Ir–CYP119 相结合生产非天然萜类化合物环丙基柠檬烯

总结与展望

萜类化合物在医药和化学工业中具有重要的应用价值。它们通常用作结构修饰的先导化合物，可以产生许多具有潜在药理作用或工业应用的新型结构。通过合成生物学技术可以获得，一些通过传统化学方法或生物技术无法高效生产的新型化学品或类似物，为扩大萜烯的化学多样性提供了新途径。目前，一些新兴技术加速了非天然萜烯生物合成的发展，包括基因组挖掘、蛋白质工程、代谢工程、组学技术、高通量技术、人工智能AI等。例如，氨基酸可以被看作是“蛋白质的语言”，利用AI在人类自然语言处理方面的最新进展，可构建精准的蛋白质语言模型。通过在公共蛋白质数据库上进行训练和循环优化，使其能够学习序列中氨基酸的排列规则（类似于蛋白质的语言规则），然后可利用这些模型评估给定的蛋白质序列，从而高效实现新型酶蛋白的设计和优化。此外，AI 技术还可用于指导途径设计，构建遗传回路和调控元件等。在不远的未来，AI技术有望在合成非经典萜类化合物的两个关键领域（设计合成途径和修饰代谢途径中的关键酶）发挥重要作用。

本文参考文献（上线划动查看）

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论文作者介绍

谌容

副教授

谌容，杭州师范大学副教授，硕士生导师，毕业于华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室访问学者，入选杭州市高层次特殊支持人才计划第二层次。研究领域为重要活性天然产物及衍生物的合成生物学及健康保护研究。主持国家自然科学基金及省市级项目五项，作为骨干参与了国家重大新药创制科技重大专项及浙江省科技厅重点项目等，在国内外核心期刊上发表高水平论文20余篇，授权发明专利10项，专利转化2项。指导学生获省级竞赛二等奖。

殷晓浦 

副教授

殷晓浦，杭州师范大学副教授，硕士生导师，浙产中药材资源开发与应用浙江省工程研究中心副主任，2007年毕业于华东理工大学“生物反应器工程国家重点实验室”并获博士学位，中国抗癌协会中西医整合肿瘤专委会青年委员，中国中医药信息学会临床药学分会理事，杭州市高层次人才C类。研究领域为高价值天然药物及其衍生物的生物合成及微生物细胞工厂构建。

主持国家自然科学基金及省市级项目十余项，作为骨干参与了十一五“重大新药创制”科技重大专项及浙江省科技厅重点项目等，在国内外核心期刊上发表高水平论文40多篇。荣获2018年教育部科技进步一等奖（排名第3）及2019年国家科技进步二等奖（排名第5），授权发明专利11项。指导学生获第八届中国国际互联网+大学生创新创业大赛金奖。获浙江省高等学校教学成果二等奖。

相关论文信息

相关研究发表在Cell Press细胞出版社旗下期刊Trends in Biotechnology，

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▌论文标题：

Expanding the structural diversity of terpenes by synthetic biology approaches

▌论文网址：

https://www.cell.com/trends/biotechn-ology/fulltext/S0167-7799(23)00345-1

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2023.12.006

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